La coloration de Kinyoun: bases et techniques

La coloration Kinyoun est une technique de coloration utilisée pour colorer les bactéries et les parasites résistant aux acides. Il est né de la modification de la coloration de Ziehl-Neelsen; Les deux techniques sont interprétées de la même façon, mais elles diffèrent par deux éléments: la préparation du réactif principal et la technique de Kinyoun n’utilise pas de chaleur.

Pour cette raison, il est également connu sous le nom de coloration à froid de Ziehl-Neelsen ou Kinyoun modifiée au froid. Il est indiqué pour la coloration de Mycobacterium tuberculosis, Micobacterium leprae, Mycobactéries atypiques, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris et Cyclosporas cayetanensis .

Il est à noter que les Nocardias ne tachent que faiblement avec cette technique, car ils résistent partiellement à l’acidité. Il existe donc une modification de la méthodologie pour ce genre.

À son tour, la technique à froid de Kinyoun a été combinée à la technique du trichrome modifiée par Didier pour la détection des coccidies ( Criptosporidium parvum et Isospora belli ) et des spores de microsporidies ( Enterocytozoon bieneusi et Encephalitozoon intestinalis ).

Fondation

Le principal réactif de coloration est le carbol-fuchsine ou la fenicaine-fuchsine, qui a la propriété de se lier aux acides phénoliques de la paroi cellulaire cireuse, riche en lipides (acides mycoliques) de mycobactéries et de certains parasites.

Cette union n'est pas neutralisée par la décoloration à l'acide; Par conséquent, les micro-organismes sont définis comme étant des alcools résistants aux acides.

Contrairement à la technique de Ziehl-Neelsen - qui fixe le colorant par la chaleur - dans la technique de Kinyoun, cette étape n'est pas nécessaire, car la solution de fuchsine phénolique préparée pour cette technique contient une forte concentration de phénol.

Le phénol dissout le matériau lipidique de la paroi cellulaire, ce qui permet l'entrée du colorant carbol-fuchsine. Une fois que le colorant a pénétré, il reste fixé malgré le lavage à l'alcool-acide.

De cette manière, les micro-organismes résistant aux acides prennent la couleur rouge caractéristique, tandis que tout ce qui n'est pas de l'alcool résistant aux acides devient décoloré et coloré en bleu.

Technique

Les matériaux

- Fuchsine phénolique modifiée.

- alcool-acide.

- bleu de méthylène.

Préparation de la fuchsine fenixée au kinyoun

- Fuchsine basique: 4 gr.

- Phénol: 8 ml.

- alcool (95%): 20 ml.

- eau distillée: 100 ml.

La fuchsine de base dans l’alcool doit être dissoute lentement, en mélangeant constamment. Ensuite, le phénol cristallisé est fondu au bain-marie à 56 ° C. Une fois dissous, 8 ml sont ajoutés à la solution de fuchsine préparée ci-dessus.

Préparation de l'alcool-acide

- Acide chlorhydrique concentré: 3 ml.

- éthanol (95%): 97 ml.

Il doit être mesuré, joint et mélangé.

Préparation du contraste de bleu de méthylène

- Bleu de méthylène: 0, 3 g.

- eau distillée: 100 ml.

Il pèse et se dissout.

Technique de coloration Kinyoun

1- Préparer un frottis directement à partir de l'échantillon, qui peut être une expectoration, un liquide pulmonaire, des sédiments d'urine, un liquide céphalo-rachidien ou des matières fécales, entre autres; ou à partir d'une suspension de microorganismes obtenus à partir de colonies pures développées dans des milieux de culture primaires.

2- Fixer le frottis avec de la chaleur.

3- Placer le frottis sur le pont de coloration et recouvrir du réactif de fuchsine phénolique de Kinyoun préparé. Laissez reposer pendant 3 ou 5 minutes.

4- Laver à l'eau distillée.

5- Blanchir à l'alcool acide pendant 3 minutes et laver à nouveau avec de l'eau distillée.

6 - Blanchir à nouveau avec de l'alcool acide pendant 1 ou 2 minutes jusqu'à ce que le colorant ne soit plus traîné.

7- Laver à l'eau distillée et laisser égoutter en plaçant la lame en position verticale.

8- Couvrir la préparation avec du bleu de méthylène et laisser reposer 4 minutes.

9- Laver à l'eau distillée et laisser sécher à l'air.

10- Examiner à 40X puis à 100X.

Si vous souhaitez améliorer et accélérer la coloration des micro-organismes acido-résistants, ajoutez 1 goutte d'un agent mouillant (tel que le tergitol n ° 7) à 30 ou 40 ml de fuchsine d'acide feniny Kinyoun.

Certains laboratoires changent le colorant de contraste au bleu de méthylène en vert clair ou en acide picrique; le premier donne une couleur verte à l'arrière-plan et le second génère une couleur jaune.

Technique Kinyoun spéciale pour Nocardias

Pour améliorer la coloration de la bactérie Nocardia, une modification de la coloration de Kinyoun est utilisée. La technique est la suivante:

1- Couvrir le frottis avec de la fuchsine phénolique Kinyoun pendant 3 minutes.

2- Laver à l'eau distillée.

3- Blusher brièvement avec 3% d’alcool acide jusqu’à ce qu’aucun colorant ne soit entraîné.

4- Laver à nouveau avec de l'eau distillée.

5- Couvrir la préparation avec du bleu de méthylène et laisser pendant 30 secondes.

6- Laver à l'eau distillée et laisser sécher à l'air.

Technique combinée de fuchsine phénolique et trichromique modifiée par Didier

Cette technique est recommandée pour l'analyse d'échantillons de selles à la recherche simultanée de coccidies et de spores de Microsporidium sp . La procédure à suivre est la suivante:

1- Couvrir le frottis avec la fuchsine phénolique Kinyoun pendant 10 minutes.

2- Retirer le colorant et laver à l’eau distillée.

3- Blanchir pendant 30 secondes avec de l'acide chlorhydrique.

4- Laver à nouveau avec de l'eau distillée.

5- Couvrir le frottis avec une solution de trichrome pendant 30 minutes à 37 ° C.

6- Laver à l'eau distillée.

7- Décolorer pendant 10 secondes avec de l'acide acétique alcool.

8- Laver le frottis pendant 30 secondes avec de l'éthanol à 95%.

Contrôle de qualité

Comme contrôle positif, les frottis sont préparés avec des souches de Mycobacterium tuberculosis et colorés avec les réactifs préparés pour vérifier que la bactérie prend la bonne couleur (rouge-fuchsia).

Les contrôles négatifs peuvent également être utilisés en préparant des frottis avec toute souche non résistante aux alcools acides, vérifiant ainsi que la totalité de l'échantillon prend la couleur de contraste.

Technique de Kinyoun comparée à la technique de Ziehl -Neelsen

La technique de Kinyoun est plus simple car elle supprime l’étape de chauffage, mais son principal avantage est d’empêcher l’émission de vapeurs, hautement toxiques et cancérogènes à long terme. Par conséquent, la coloration de Kinyoun est plus sûre pour le personnel en charge de la coloration.

Il est important de prendre en compte qu'il est nécessaire de veiller à ce que les réactifs n'entrent pas en contact direct avec la peau, car ils sont corrosifs et l'eau de Javel est inflammable.

En ce qui concerne les inconvénients, un frottis négatif n'indique pas nécessairement que le microorganisme n'est pas présent. De plus, la présence de détritus cellulaires peut provoquer des faux positifs, ce qui génère une confusion dans le diagnostic.

Référence

1. Chimie Clinique Appliquée (2016). BK Kinyoun Kit disponible à l'adresse suivante: cromakit.es
2. Orozco-Rico Miguel. Tache de Kinyoun et deux coccidies chez le VIH. Journal médical MD. 2011; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnostic microbiologique de Bailey & Scott. 12 éd. Argentine Editorial Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, W Janda, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostic microbiologique. (5 e éd.). Argentine, Éditorial Panamericana SA
5. Contributeurs Wikipedia. «Tache de Kinyoun.» Wikipedia, l'Encyclopédie Libre . Wikipedia, The Free Encyclopedia, 8 février 2018. Web. 5 janvier 2019.
6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Application d'une technique de coloration pour le diagnostic simultané des coccidies et des microsporidies. Institut d'Hygiène de l'Université de la République. Montevideo. Uruguay Disponible à l'adresse suivante: higiene.edu.uy