Protéinase K: caractéristiques, activité enzymatique et applications

La protéinase K est une enzyme appartenant au groupe des sérine protéases, c’est-à-dire qu’elle a à son centre catalytique actif une sérine d’acide aminé et a pour fonction de rompre les liaisons peptidiques par hydrolyse. Cette enzyme, à son tour, appartient à la famille des protéines de la subtilisine (peptidase S8).

La protéinase K a un poids moléculaire de 28 900 daltons et a été isolée pour la première fois en 1974 à partir d’extraits du champignon Engyodontium album, anciennement connu sous le nom de Tritirachium album Limber.

Il présente une capacité protéolytique élevée, démontrée comme capable de dégrader la kératine présente dans les cheveux. Le mot kératine en anglais est écrit "kératine", c'est pourquoi il a été appelé "protéinase K".

En raison de sa grande capacité à cliver les protéines natives, cette enzyme est utile dans diverses techniques de biologie moléculaire. Il est principalement utilisé pour isoler et préparer des acides nucléiques à haut poids moléculaire (MW).

La protéinase K agit en libérant l'ADN nucléaire, en détruisant les protéines et en inactivant les RNases et les DNases, c'est-à-dire en éliminant les nucléases des préparations d'ADN et d'ARN.

D'autre part, il a été constaté que la protéinase K peut hydrolyser certaines protéines natives dénaturées, ce qui a suscité l'intérêt des chercheurs pour son utilisation dans l'étude des protéines prions (PrP C).

Cependant, malgré son pouvoir protéolytique élevé, certaines protéines résistent à l'action de la protéinase K. Parmi celles-ci, il existe des protéines anormales appelées prions (PrP Sc), associées à des encéphalopathies spongiformes transmissibles.

Caractéristiques de la protéinase K

La protéinase K a une structure tertiaire formée de trois couches, avec une feuille β de sept chaînes intercalées entre deux couches d'hélices. Parce qu’elle appartient à la famille des peptidases S8, elle se caractérise par le fait qu’elle possède dans son site actif une triade catalytique dont l’ordre séquentiel est (Asp, His et Ser), ce qui les différencie des autres familles de peptidases.

Cette enzyme du groupe des sérine protéases est caractérisée par l'hydrolyse des liaisons peptidiques proches du groupe carboxylique des acides aminés aliphatiques et aromatiques.

D'autre part, il est capable d'agir en présence de certaines substances corrosives, telles que le dodécylsulfate de sodium (SDS), le Tris-HCL et l'EDTA, qui sont utilisées pour aider à la dénaturation des protéines, leur faisant perdre leur structure native.

Il s'agit d'une étape préliminaire dans la préparation de protéines pour la technique d'électrophorèse. La plage de pH dans laquelle agit la protéinase K est assez large (2, 0 à 12, 0), avec un pH optimal compris entre 7, 5 et 12, 0 et son point isoélectrique à 8, 9. Comme on peut le constater, il est actif contre une très large gamme de pH.

Une autre caractéristique de la protéinase K est sa stabilité en présence de températures élevées (50 - 60 ° C).

Activité enzymatique

La protéinase K a besoin de la présence d’ions calcium, bien que cela n’affecte pas son activité, s’il est essentiel de maintenir sa stabilité.

Pour que la protéinase K puisse digérer complètement le substrat, un temps de contact approximatif compris entre 5 minutes et 2 heures est nécessaire.

Cependant, dans ce sens, Daza et ses collaborateurs ont comparé la pureté de l’ADN obtenu à divers moments d’exposition à la protéinase K et ont conclu qu’une incubation prolongée (jusqu’à 24 h) améliorait considérablement la qualité de l’ADN.

Or, en ce qui concerne la concentration utilisée de l'enzyme protéinase K dans les différents protocoles, on peut dire qu'elle est très variée.

Il peut être utilisé à partir de très faibles concentrations (5 µg / ml) jusqu'à des concentrations de 500 µg / ml. Mais les concentrations de travail les plus fréquentes varient entre 50 et 100 µg / ml, en particulier pour la digestion des protéines et l’inactivation des nucléases. Bien qu'une concentration de 2 mg / ml soit requise pour le traitement des tissus.

Les applications

Ses applications sont très larges et peuvent être résumées comme suit:

-Il est utilisé dans la digestion des protéines et l'extraction de l'ADN par plusieurs méthodes telles que: relargage, PK-SDS, bromure de cétyl-triméthyl ammonium (CTAB), acétate de potassium modifié et extraction à l'iodure de sodium.

-Inactivation des nucléases (RNases et DNases).

-Dans la technique d'hybridation in situ (HIS), pour aider à la libération d'acide nucléique, en plus d'éliminer les protéines indésirables.

-Modification de protéines.

-Au niveau de la recherche, dans diverses études.

Avantages de la protéinase K

Plusieurs études comparatives ont été menées sur les techniques d’extraction d’ADN utilisant la protéinase K, d’autres ne l’utilisant pas et concluant toutes à l’avantage de l’utilisation de l’enzyme. Parmi les avantages, on peut citer les suivants:

- Un ADN de poids moléculaire élevé, de haute qualité et de pureté est obtenu.

-L'ADN extrait est stable jusqu'à 3 mois.

L'ADN extrait peut être utilisé dans les techniques suivantes: transfert de Southern, réaction en chaîne de la polymérase (PCR), électrophorèse, entre autres.

Protéines résistantes à la protéinase K

Plusieurs études ont conclu que les prions (protéines toxiques anormales à la PrPSc) se différencient des protéines PrPC (natives) car elles résistent à l'action de la protéinase K, alors que les PrPC sont sensibles à leur action.

D'autres auteurs ont décrit la présence de parties sensibles dans la structure de PrPSc et d'autres résistantes à la protéinase K. Cependant, les deux parties sont également toxiques et infectieuses.

Par ailleurs, Bastian et ses collaborateurs ont isolé en 1987 4 protéines de 28, 30, 66 et 76 kda d’une espèce de Spiroplasma mirum . Tous étaient résistants à l'action de la protéinase K et présentaient également une réaction croisée avec certains prions.

On sait que cette espèce peut provoquer des cataractes et des dommages neurologiques importants. En raison des découvertes scientifiques de Bastian, entre autres investigations, on a tenté de relier ce microorganisme aux encéphalopathies spongiformes transmissibles.

Cependant, l'étiologie de cette pathologie neurologique dégénérative est toujours attribuée aux prions.

En ce sens, Butler et ses collaborateurs en 1991 ont identifié et caractérisé une classe de protéines résistantes à la protéinase de 40 Kda provenant de deux souches de Mycoplasma hyorhinis. Cet agent pathogène affecte les porcs, infectant leurs tissus, mais dans ce cas, il n'y a pas eu de réaction croisée avec les prions testés.

Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour élucider de nombreuses inconnues à ce sujet.