Bouillon Malonato: fond de teint, préparation et utilisations

Le bouillon de malonate est le milieu de culture liquide utilisé pour le test de diagnostic (test de malonato), utilisé pour différencier certains genres de la famille des Enterobacteriaceae. Il a été créé par Leifson en 1933 puis modifié par Ewing, qui a ajouté une petite quantité d'extrait de dextrose et de levure à la formule d'origine.

Le milieu est actuellement composé d'extrait de levure, de sulfate d'ammonium, de phosphate dipotassique, de phosphate monopotassique, de chlorure de sodium, de malonate de sodium, de dextrose et de bleu de bromothymol. Ce test est généralement inclus dans la batterie d'identification biochimique des entérobactéries, ce qui permet de différencier certains genres et espèces.

Le test du malonate repose principalement sur la capacité de certains microorganismes à utiliser le malonate de sodium comme seule source de carbone et le sulfate d’ammonium comme source d’azote.

Le test au malonate est généralement positif chez certaines espèces des genres Enterobacter, Klebsiella et Citrobacter. Alors que la majorité des espèces des genres Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus et Providence ont une réaction négative.

Fondation

Le test au malonate consiste à démontrer les bactéries capables d’utiliser le malonate de sodium comme seule source de carbone et le sulfate d’ammonium comme source d’azote.

La majorité des entérobactéries qui n'utilisent pas de malonate sont capables de se développer dans ce milieu, en prenant du dextrose et de l'extrait de levure comme nutriments.

Dans ce cas, toute tentative d'alcalinisation par l'utilisation de peptones sera contrecarrée par la production d'acides générés par la fermentation du dextrose. De même, les phosphates dipotassiques et monopotassiques agissent comme un tampon maintenant le pH à 6, 7.

C'est pourquoi, lorsque le test est négatif, le bouillon a la même couleur d'origine (vert). Dans de rares cas, le milieu pouvait être acidifié en raison de la fermentation du dextrose; sans l'utilisation des peptones et de l'indicateur de pH, la couleur du support virerait au jaune. Pour que cela se produise, le pH doit chuter à 6.

Maintenant, lorsque ce test est positif, on dit que le microorganisme a utilisé respectivement du malonate et du sulfate d’ammonium comme sources de carbone et d’azote, sans utiliser les autres composants.

Dans ce cas, le milieu devient alcalin en raison de la libération de sodium et de la formation de NaOH qui en résulte. En ce sens, l'indicateur de pH (bleu de bromothymol) passe du vert au bleu lorsque le pH est égal ou supérieur à 7, 6. Le bleu peut être clair ou intense (bleu de Prusse).

Enfin, le chlorure de sodium maintient l'osmolarité du milieu et l'eau est le diluant de tous les composants.

D'interprétation

Bouillon de même couleur (vert): test négatif

Bouillon jaune: test négatif

Bouillon bleu clair ou intense: preuve positive

Il existe un variant appelé bouillon phénylalanine malonate, également appelé milieu Shaw et Clarke. Dans ce cas, deux tests peuvent être analysés, l’utilisation du malonate comme source de carbone et la production d’acide pyruvique à partir de phénylalanine.

préparation

Bouillon Malonato

La quantité de grammes spécifiée par l'insert de la maison commerciale choisie est pesée (elle peut varier de l'une à l'autre). Les grammes lourds sont suspendus dans un litre d'eau distillée. Chauffer légèrement jusqu'à dissolution complète. Distribuer 3 ml du milieu dans des éprouvettes 13/100 avec un couvercle en coton.

Stériliser à l'autoclave à 121 ° C pendant 15 à 20 minutes.

Cool avant utilisation. S'ils ne vont pas être utilisés immédiatement, conservez-les au réfrigérateur jusqu'à leur utilisation. Tempérez les bouillons à la température ambiante avant de les inoculer.

Le pH du milieu devrait être de 6, 7 ± 0, 2. La couleur du support préparé est vert bouteille.

Bouillon de malonate de phénylalanine

Peser 11 g du milieu déshydraté et dissoudre dans 1 litre d'eau distillée. Le reste de la préparation est identique à celui décrit ci-dessus.

Il peut également être préparé en ajoutant 2 gr / L de phénylalanine au milieu du bouillon de malonate avant sa stérilisation.

Utiliser

Il fait partie de la batterie de tests biochimiques mis au point pour l'identification des bactéries de la famille des entérobactéries.

Aide à distinguer entre:

-Les genres Klebsiella et Enterobacter (+) du genre Escherichia et Serratia (-).

-Les espèces de Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame et Salmonella enterica ssp diarizonae (+), de l'espèce Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Du genre Klebsiella généralement (+) du genre Actinobacillus (-).

-Il peut parfois aider à différencier les genres et les espèces de bactéries n'appartenant pas à la famille des Enterobacteriaceae, par exemple entre les bacilles à Gram négatif non fermentants Alcaligenes faecalis (+) et Acinetobacter sp (-).

La procédure

Sous un briquet, une partie d'une colonie pure est prélevée à l'aide d'un manche en platine correctement stérilisé et refroidi. L'échantillon prélevé (inoculum léger) est dissous dans le bouillon de malonate. Il est incubé avec le couvercle desserré en aérobiose à 35 ° C ± 0, 2 pendant 24 à 48 heures.

Le bouillon de malonate peut également être inoculé à partir d’une culture de 18-24 heures dans du bouillon trypticase soja. Dans ce cas, 0, 01 ml est pris avec une pipette stérile et le bouillon de malonate est inoculé. Il est incubé avec le couvercle desserré en aérobiose à 35 ° C ± 0, 2 pendant 24 à 48 heures.

A la fin du temps, les résultats sont interprétés. Toute trace de couleur bleue culminant après 48 heures d'incubation doit être considérée comme positive. Le test ne doit pas être interprété négatif jusqu'à la fin de la période d'incubation de 48 heures.

Dans le cas d'utilisation du variant de bouillon phénylalanine malonate, le malonate est d'abord interprété, puis 5 gouttes de HCL 1N et 3 à 5 gouttes de chlorure ferrique à 8% sont ajoutées. Une couleur vert foncé est interprétée comme un test positif à la phénylalanine. Si, en revanche, le milieu devient bleu pâle, le test est négatif pour la phénylalanine.

Contrôle de qualité

Pour effectuer le contrôle de stérilité du milieu, un ou deux bouillons doivent être incubés à 35 ° C ± 0, 2 pendant 24 heures d’incubation. Au bout de ce temps, il ne devrait y avoir aucune turbidité, aucun changement de couleur.

Pour le contrôle de la qualité, des souches connues ou certifiées peuvent être utilisées, telles que: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 et Escherichia coli ATCC 25922.

Les résultats attendus sont:

Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae et Salmonella enterica ssp arizonae donnent une réaction positive (couleur bleu moyen).
Pour Escherichia coli, le résultat doit être négatif, c'est-à-dire qu'il est prévu qu'il n'y ait pas de changement de couleur (vert) ou qu'il jaunisse à cause de la fermentation du glucose.